Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод исследования, который используется для выявления наличия определенных генетических материалов в образцах биологической среды человека, животных и растений. Если сократить область применения данного метода, то создается ПЦР-диагностика – исследование, которое позволяет выявить возбудителя разной природы за считанные часы.

Чем же привлекает ПЦР-диагностика? Стоит отметить, что она обладает рядом неоспоримых преимуществ перед другими методами анализа. Первое и, пожалуй, главное ее преимущество – абсолютная точность. В отличие от других анализов, которые могут дать явные ошибки, издержки или просто неправильные результаты, метод ПЦР безошибочно определяет наличие своих объектов исследования.

Особенностью ПЦР-диагностики является то, что даже малейшее количество генетического материала возбудителя можно обнаружить в биологическом образце. Отдельно стоит отметить, что метод может применяться для выявления нескольких заболеваний сразу, что упрощает и ускоряет процесс постановки диагноза.

Описав основные преимущества данного метода, следует обратить внимание на этапы проведения ПЦР-диагностики. Уже на начальной стадии данной процедуры изучают образец биоматериала (кровь, мазок из носоглотки, слюна, моча, сперма и так далее) и анализируют его качество и количество.

Далее начинается основной этап ПЦР-диагностики: в рамках реакции биоматериал смешивается с реагентами и попадает в определенную термическую зону. Внутри нее проводится ряд технологических операций, в результате которых возбудитель переходит в состояние, когда его можно обнаружить. Финальный этап – получение результатов исследования.

Итак, ПЦР-диагностика является надежным и точным методом исследования, который уже несколько лет назад стал одним из главных инструментов врачей при постановке диагнозов в области инфекционных и вирусных заболеваний.

Описание ПЦР-диагностики: что это такое?

Сегодня ПЦР-диагностика, которая появилась более 30 лет назад, является одним из наиболее точных способов обнаружения инфекций. В такой диагностике используется метод, основанный на принципе многократного увеличения микроскопических концентраций фрагментов ДНК возбудителя в биологической пробе пациента в искусственных условиях. При этом производится амплификация, то есть простое увеличение числа копий молекулы ДНК, которая присутствует только у определенного вида патогенного микроорганизма, который интересует врача. Этот процесс происходит под воздействием ферментов и изменения температуры (от 50 до 95°С) и в результате сложного процесса образуется две молекулы ДНК из одной.

Цикл процесса образования новой молекулы ДНК занимает около 3 минут, и необходимое для достоверного визуального определения количество молекул получается после тридцати-сорока циклов.

С помощью ПЦР также можно производить различные манипуляции с генетическим материалом, такие как сращивание фрагментов ДНК, ввод мутаций и т.д. Использование ПЦР возможно не только для диагностики инфекционных и генетических заболеваний, но и для выделения новых генов и установления отцовства.

Эта диагностика проводится в специальных лабораториях, где используется амплификационное оборудование. Существует множество различных модификаций ПЦР, включая технологии, где используется не только ДНК, но и фрагменты рибонуклеиновой кислоты (РНК). Некоторые из этих модификаций не требуют специального оборудования, а амплификация осуществляется при постоянной температуре.

Одна из таких модификаций - «горячий старт ПЦР», которая подразумевает предварительное прогревание пробирок с амплификационной смесью при температуре 95°С в течение 3–5 минут, чтобы исключить клонирование неспецифических ДНК-фрагментов.

Одна из популярных модификаций ПЦР - мультиплексная амплификация (МПА), которая позволяет проводить исследования сразу нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке. Поэтому, она ускоряет и удешевляет анализ, при этом увеличивает точность исследования методом ПЦР.

Одним из наиболее востребованных методов анализа в клинической медицине является ПЦР-диагностика. Этот метод находит применение в самых различных сферах.

В области урогинекологии ПЦР-диагностика используется для выявления половых инфекций, характеризующихся слабой выраженностью симптомов и часто вызывающих бесплодие и невынашивание беременности у женщин. При помощи ПЦР можно выявить наличие целого «букета» инфекций, включая хламидиоз, несколько видов микоплазмы, уреаплазму, трихомониаз, гарднереллу, кандиду, гонококк и трепонему. Кроме этого, времянка и точность ПЦР-диагностики позволяют выявить генитальный герпес и вирус папилломы человека, предотвращая риск развития злокачественных заболеваний шейки матки у женщин.

В неонатологии ПЦР-диагностика эффективно выявляет наличие неонатальных инфекций у плода уже в утробе матери и у новорожденных. Среди опасных заболеваний отмечаются цитомегаловирус, токсоплазмоз, вирусы краснухи и герпеса, хламидии и микоплазмы.

Пациентам, инфицированным опасными заболеваниями крови или плазмы, такими как ВИЧ, сифилис, гепатиты, также требуется ПЦР-диагностика для избежания риска переливания крови. Метод ПЦР значительно превосходит по точности серологические методы, позволяя выявлять даже инфекции, имеющие длительный инкубационный период, которые не могут быть обнаружены обычными исследованиями в первые несколько недель.

В клинике инфекционных заболеваний ПЦР-диагностика применяется для выявления различных инфекций, включая вирусы гепатита, СПИД, холеры, бруцеллеза, туляремии, дифтерии и токсоплазмоза.

В фтизиатрии и пульмонологии ПЦР-диагностика является неоценимым инструментом для выявления возбудителей атипичных форм пневмонии и хронических рецидивирующих бронхитов, таких как хламидии и микоплазмы. Этот метод также позволяет проводить видовую идентификацию возбудителя и своевременно поставить диагноз туберкулеза.

Помимо клинической медицины, ПЦР-диагностика находит применение в криминалистике, экспериментальной медицине, создании генетических паспортов, мониторинге состояния окружающей среды, анализе продуктов питания, фармакологии и ветеринарии.

Переваги ПЦР-діагностики

Незважаючи на те, що Полімеразна Ланцюгова Реакція (ПЦР) є відносно "молодим" методом, ключове місце в медичній практиці вона займає завдяки очевидним перевагам порівняно з іншими методами аналізу:

• Пряме визначення збудника інфекції. Деякі традиційні методи, такі як імунноферментний аналіз (ІФА), виявляють лише білки-маркери, які є продуктом життєдіяльності збудників інфекції, і тому лише опосередковано вказують на присутність мікроорганізмів. Наявність специфічного участка в ДНК, виявленого за допомогою ПЦР, безпомилково або майже безпомилково вказує на присутність конкретної інфекції.
• Висока специфічність методу. Вона обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється фрагмент ДНК, який характерний лише для конкретного збудника інфекції. Специфічність виключає можливість помилкових результатів аналізу, тоді як в імунологічних методах досліджень помилки досить ймовірні через перехресну реакцію антигенів.
• Висока чутливість. Завдяки ПЦР-діагностиці можна виявити присутність навіть одиничних клітин вірусів або бактерій в організмі в тих випадках, коли звичайними методами це практично неможливо зробити. ПЦР визначає наявність всього 10-100 клітин у зразку, тоді як імунологічними та мікроскопічними тестами можна визначити наявність інфекції при кількості клітин не менше 103-105.
• Універсальність. Схожість складу всіх ДНК або РНК дає можливість застосовувати універсальні методи лабораторних досліджень, діагностуючи єдиновременно кілька збудників із одного біологічного зразка.
• Швидкість отримання результатів. Оскільки для проведення ПЦР-діагностики не потрібен посів та виділення культури збудника, то і багато часу на це не потрібно. Весь цикл - від забору біоматеріалу до отримання результатів - займає 4-5 годин.
• Діагностика латентних інфекцій. ПЦР-методом діагностуються складні форми мікроорганізмів, які зустрічаються в тих випадках, коли захворювання перебігає у прихованій формі.

Методом ПЦР можна виявити збудників інфекції не тільки в організмі людини, але й у грунті, воді, продуктах харчування.

Ограничения ПЦР-диагностики

Не смотря на то, что ПЦР-диагностика является одним из самых эффективных и популярных методов диагностики, у неё есть свои ограничения. Однако, это ограничения настолько незначительны, что не могут негативно сказаться на эффективности метода.

Ограничения метода включают следующее:

• Вероятность амплификации ДНК не только живых, но и погибших микроорганизмов.
• Возможность возникновения перекрестной реакции.
• Изменчивость микроорганизмов.

Для контроля эффективности лечения при проведении ПЦР-диагностики необходимо соблюдать определенные требования. Например, проводить ПЦР нужно после определенного промежутка времени (1-2 месяца), за который происходит полное исчезновения возбудителя инфекции в организме.

Теоретически, перекрестная реакция может возникнуть, если фрагменты ДНК праймеров будут совпадать с фрагментами ДНК, присутствующими в других микроорганизмах, чей геном на данный момент еще не расшифрован.

За счёт изменчивости микроорганизмов некоторые его штаммы могут стать неуловимыми в процессе ПЦР-анализа.

Стандарты объемов испытаний тест-систем ПЦР-диагностики разрабатывались для того, чтобы уменьшить риски ложноположительных результатов анализа, и включающие проверку на перекрестные реакции, а также тестирование всех известных штаммов конкретного возбудителя.

Метод ПЦР является прецизионной диагностической процедурой, проводимой на нескольких этапах в специализированной лаборатории.

Первый этап - забор биоматериала для исследования, который осуществляется в процедурном кабинете соответствующего профиля. Для диагностики используется эпителиальные соскобы со слизистых оболочек, моча, мокрота, кровь, плазма, сыворотка, биологические жидкости и биоптаты. Забор материала производится при помощи стерильного оборудования только в стерильные пробирки и с соблюдением всех рекомендаций.

Второй этап - хранение и транспортировка биоматериала. Допустимо хранение биоматериалов в течение двух недель при температуре -20°С, но оттаивание и повторное замораживание проб запрещено. Транспортировка, если необходима, должна проводиться в специальных термоконтейнерах или термосах.

Третий этап - выделение ДНК из образца. Метод выделения зависит от вида определяемого микроорганизма и от вида биологического образца.

Четвертый этап - проведение ПЦР. Пробирки с образцами переносятся в специальную микроцентрифужную пробирку, куда добавляется амплификационная смесь. Пробирки устанавливают в программируемый термостат, и автоматическим образом проводится амплификация.

Пятый этап - регистрация результатов. Фрагмент ДНК, характерный для возбудителя инфекции, выделяют методом электрофореза.

Шестой этап - интерпретация результатов исследования. Результат может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный результат говорит о том, что в организме человека обнаружены следы инфекции. На основании количественного результата можно сделать вывод о степени активности заболевания и определить характер лечения.

Стоимость ПЦР-диагностики: Что влияет на цену?

Цена на ПЦР-диагностику может очень сильно варьироваться и зависит от нескольких факторов. Как отмечается в статье, стоимость анализа зависит от конкретной инфекции, на которую пациент планирует проверяться, а также от вида анализируемого материала и методики тестирования - качественной или количественной. В разных медицинских клиниках цена за определение одной инфекции может варьироваться от 200 до 800 рублей.

Но это не все затраты, связанные с проведением ПЦР-диагностики. К стоимости анализа добавится оплата за забор биоматериала, которая составляет около 400 рублей. Примерные цены на анализы ПЦР в Москве приведены в таблице 1, где указаны цены на определение ДНК и РНК различных инфекций и вирусов.

Кроме того, многие медицинские центры предлагают провести ПЦР-исследование комплексно, включая несколько анализов в одном пакете услуг. Например, «ПЦР-8», который включает в себя восемь бактериальных и вирусных возбудителей острых кишечных инфекций, обойдется в 1400 рублей, а «ПЦР-12», включающий 12 половых инфекций, - в 3500 рублей. Комплексное проведение анализов позволяет существенно сэкономить деньги, поскольку отдельное прохождение ПЦР-диагностики для каждой инфекции будет гораздо дороже.

Фото: freepik.com